Studienergebnisse zum Nachweis von Prionen in Peptiden tierischen Ursprungs

In 2012 haben russische Wissenschaftler einen Test auf die Anwesenheit von Prionen in Peptiden tierischen Ursprungs durchgeführt. Diese Studie wurde im Labor für Pathologie viraler Infektionen des Forschungsinstituts für Grippe bei der Russischen Akademie Medizinischer Wissenschaften durchgeführt. Untersucht wurden Rohstoffe für die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln — Peptidkomplexe (Proteinhydrolysate) aus Geweben der Jungtiere (Schwein, Kalb) mit einer Molekularmasse bis zu 10 kDa. Die Prüfung auf das Vorhandensein von Prionen wurde nach, in Russland zugelassenen (1) und von der WHO empfohlenen (2), Methoden durchgeführt:

Previtalica Studie Laborant arbeitet am Mikroskop

Eingehende Untersuchung der Proben wurde mit der Verwendung von empfindlichsten Methoden zum Nachweis von Prionproteinen durchgeführt: Western Blot-Methode (Immunblot) unter Verwendung von Testsysteme der Firma "Prionics AG" und Elektronenmikroskopie.

Begründung für die Untersuchung

Allgemeinen Bestimmungen

Prioninfektion — langsam fortschreitende Erkrankung von Tieren (Schafe Scrapie, BSE bei Rindern) und Menschen (Kuru, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit), die mit Störungen des zentralen Nervensystems verläuft und zwangsläufig zu dem Tod führt.

Infektionserreger, die Krankheiten in dieser Gruppe hervorrufen, — infektiöse Prionen (PrPSc), sind eine pathologische Form von normalen zellulären Proteinen (PrPC), die in Körperzellen von Säugetieren vorliegen. Aggregate des Prion-Proteins in infizierten Zellen sind von Struktur und Eigenschaften dem Amyloid-Protein ähnlich, aber im Gegensatz zu diesen sind sie resistent gegen proteolytische Verarbeitung. Molekulargewichte aller, bisher erkannten, Prion-Proteine befinden sich zwischen 20 und 31 kDa.

Verfahren zum Nachweis von Prionen

Prionen-Aggregate können im Gewebe oder Rohstoffprobe histochemisch, mit Hilfe des Farbstoffs Kongorot, erkannt werden. Gefärbte Proben werden auf einem dunklen Hintergrund mit gekreuzten Polarisatoren untersucht. Amyloid-Aggregate werden in Form von leuchtenden Fasern, aber auch als grünen und smaragdgrünen Gerinnseln sichtbar. Diese Methode wird von der WHO und der Veterinärmedizinischen Abteilung der Russischen Föderation als primäre Screening-Verfahren zum Nachweis von Prioninfektionen und Prüfung von Produkten tierischen Ursprungs empfohlen.

Kleinere Aggregate von einzelnen Prionmolekülen, die mittels histochemischen Verfahren nicht nachweisbar sind, können mittels Elektronenmikroskopie, in Form von sogenannten Prionstangen und Scrapie-assoziierte Fibrillen (SAF) bei einer 30000 - 50000-facher Vergrößerung, identifiziert werden. Behandlung der untersuchten Proben mit Proteinase K ermöglicht die infektiöse Prionproteine von nicht infektiösen (zellulären) und von strukturähnlichen Proteinen zu unterscheiden. In Verbindung mit dem Verfahren der Prionkonzentration ist die Elektronenmikroskopie empfindlicher als die histochemische Färbung.

Die empfindlichste Methode zum Nachweis von Prionen ist die Western Blot-Methode (auch Immunblot (engl. Immunoblot) mit Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das Prionprotein (PrPSc und PrPC). Diese Methode wird sowie für Forschungszwecke als auch für kommerzielle Untersuchungen von Fleisch auf Prioninfektion in der Europäischen Union verwendet.

Material und Methoden

Untersucht wurden Proben von Rohstoffen für die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln. Die Proben stellten cremefarbenes Pulver dar, verpackt in hermetisch versiegelten Plastikbeuteln. Für die Identifizierung von Prionproteinen in den Testproben wurden histochemische Färbung, Elektronenmikroskopie- und Western Blot-Methode verwendet.

Histochemische Färbung

Auf einem Objektglas mit Alkohol befestigte Testproben wurde innerhalb von 3 Stunden mit einer 1% wässrigen Lösung des Farbstoffs Kongorot, nach der Standard-Pierce-Methode, gefärbt. Danach wurde die Testproben für 60 Sekunden mit einer 1% Lösung von Kaliumiodid behandelt und anschließend, um von dem ungebundenen Farbstoff zu befreien, im Ethanol 70%, dreimal für 10 Minuten, mit Ethanolaustausch gewaschen. Die Begutachtung der Proben wurde in einem dunklen Feld mit gekreuzten Polarisatoren mit einer 300- bis 600-facher Vergrößerung durchgeführt. Als positive Kontrolle wurden histologische Präparate menschlichen Amyloid Niere verwendet.

Elektronenmikroskopie

Für die Erhöhung der Empfindlichkeit der elektronenmikroskopischen Untersuchung wurde die Konzentration von Fraktionen des aggregiertem Proteins in den Testproben mittels 3-fachen Einfrieren-Auftauens der gesättigten Probenlösung, erhöht. Danach wurden 5 ml Lösung von jede Testprobe bei 120000 g für 2 Stunden in einer Ultrazentrifuge L-8 ("Beckman", USA) zentrifugiert. Das erhaltene Sediment wurde in 50 Mikroliter [µl] des zweifach destillierten (bidestillierten) Wassers gelöst. Damit wurde etwa die 200-fache Konzentration an Fraktionen, die Prionen enthalten können, erreicht. Das konzentrierte Sediment des aggregierten Proteins wurde auf Form-Kohlenstoff-Trägerfolien aufgetragen und einer proteolytische Behandlung mit Proteinase K ("Sigma", USA) bei einer Konzentration von 0,2 mg/ml für 20 min bei 37 °С unterzogen. Die Trägerfolien wurden für die Kontrastverbesserung mit einer 1,5% Lösung von Natriumphosphat-Wolframat (pH 6,7) behandelt und unter einem Elektronenmikroskop (Modell JEM-100S, JEOL, Japan) mit einer 30000- bis 100000-facher Vergrößerung, mit dem Ziel das Vorhandensein von "Prion Stangen" und SAF zu identifizieren, untersucht. Als positive Kontrolle wurden Hefe-Prionen verwendet. Sie sind in ihrer Morphologie und Stabilität mit den Prionen von Säugetieren sehr ähnlich.

Western Blot-Methode (Immunoblot)

Die Western Blot-Methode wurde gemäß Richtlinien der Firma "Prionics" zum Testsystem mit monoklonalen Antikörpern das Prionprotein (PrPSc und PrPC) durchgeführt. Die Testproben wurden in einem speziellen Puffer auf eine Konzentration von 10% homogenisiert, mit SDS-mercaptoethanol Puffer denaturiert und dann mit einer Menge von 10 Mikroliter [µl] auf der Oberfläche eines Polyacrylamidgels in der Kassette (Mini Protean II, "Biorad", USA) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde bei einer Spannung von 80 V für 2 h durchgeführt. Eine der erhaltenen Platten wurde nach Coomassie gefärbt, mit der anderen wurde ein Elektrotransport des Materials auf eine große PVDF-Membran mit einer Spannung von 40 V für 10 h bei 4 °С (Transfer Tank "Biorad", USA) durchgeführt. Die Verteilung des Proteins auf der Membran wurde unter Verwendung von Essigsäure-Lösung "PonceauS" für 2 Minuten durchgeführt, dann wurde die Membran mit einem Puffer BLOCK (PRIONICS check-kit) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Inkubation mit den monoklonalen Antikörpern 6N4 (1:2500) wurde über Nacht bei 4 °С durchgeführt. Nach Inkubation mit sekundärem Antikörper (goat-antimouse) wurde das Signal mittels des chemilumineszierenden Substrats NBT/BCIP, gemäß den Herstellerrichtlinien, identifiziert.

Studienergebnisse

Histochemische Färbung

Bei der Untersuchung der o.g. Rohstoffproben für die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln, wurden keine Amyloid-Aggregate von Proteinen, und keine Prionen identifiziert. Nach der Färbung der untersuchten Proben wurde in einem dunklen Feld kein leuchtendes Aggregat beobachtet. Bei der Untersuchung der positiven Kontrollprobe von Amyloid-Niere wurden charakteristische faserige gelb-grün leuchtende Aggregate von Amyloid beobachtet.

Elektronenmikroskopie

Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung des Sediment-Konzentrates aus den vorgestellten Proben, wurden keine Prion-Strukturen in Form von sogenannten "Prion-Stangen" und keine Scrapie-assoziierte Fibrillen identifiziert. Auf den Form-Kohlenstoff-Trägerfolien wurden nur Spuren von Sorption niedermolekularer Verbindungen nachgewiesen. Auf den positiven Kontrollproben wurden Hefe-Prionen in Form von charakteristischen Fibrillenstrukturen (SAF) erkannt.

Western Blot-Methode (Immunoblot)

Bei der Durchführung der Elektrophorese mit Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen das Prionprotein (zellulär und infiziert) wurden in keine der vorgestellten Testproben Proteine mit einem Molekulargewicht über 20 kDa (Molekulargewicht von Prionproteinen — 27-30 kDa) festgestellt. Nach der Inkubation der PVDF-Membrane mit den Proben ohne Proteinase K-Behandlung, mit Antikörper 6N4 Behandlung und der Färbung wurde in den Proben keine Merkmale einer Bindung identifiziert. Somit konnten in den Proben mit der Western Blot-Methode keine Prionproteine gefunden werden.

Zusammenfassung

Mit dem Ziel Prionproteine in Proben von Rohstoffen für die Herstellung von Nahrungsergänzungsmitteln zu identifizieren, wurde im Labor für Pathologie viraler Infektionen des Forschungsinstituts für Grippe bei der Russischen Akademie Medizinischer Wissenschaften eine Reihe von Untersuchungen nach dem von WHO empfohlenen und von der Veterinärabteilung des Landwirtschaftsministerium der Russischen Föderation genehmigten Diagnoseverfahren wie, histochemische Färbung, Elektronenmikroskopie und Western Blot-Methode (Immunblot) mit der Verwendung von monoklonaler Antikörper gegen Prionproteine, durchgeführt.

Mit keiner dieser Methoden wurde das Vorhandensein von Prionen festgestellt.

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